MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DA INFECÇÃO PELO HELICOBACTER PYLORI

Para o diagnóstico de infecção pelo H. pylori há métodos invasivos: histologia com coloração pela Hematoxilina - Eosina (HE) e Giemsa, teste rápido da urease CLO e cultura a partir de biópsia gástrica. Os métodos não invasivos foram, posteriormente, introduzidos na prática clínica: sorologia por enzima imunoensaio com pesquisa de IgG anti-H. pylori, teste rápido da ponta de dedo que pesquisa anticorpo anti-H. pylori e teste respiratório com 14C-uréia e 13C-uréia. Na histologia, o H. pylori é visto aderido à célula epitelial, ou escondido sob o muco do estômago na coloração pelo HE, sendo melhor visualizado nos cortes corados pelo Giemsa.

O teste rápido da urease CLO caseiro preparado no nosso laboratório consiste de tampão fosfato com uréia, extrato de levedura e vermelho fenol pH 6,9. O vermelho fenol fica amarelo no pH ácido e rosa carmim no pH alcalino. A solução é esterilizada em membrana millipore, aliquotada e congelada. Se a biópsia gástrica tem H. pylori, com a produção da urease a uréia é metabolizada em bicarbonato e amônia, o meio passa de ácido para alcalino, ocorrendo viragem da cor de amarelo para cor-de-rosa. A leitura é realizada em até 24h.

A cultura a partir de biópsia gástrica é demorada. A mucosa gástrica precisa ser macerada antes da semeadura para aumentar o crescimento das colônias, em vez de simplesmente passar-se a biópsia pela superfície da placa, evitando os falsos negativos. A cultura com antibiograma não é essencial para o diagnóstico de infecção pelo H. pylori, entre os outros exames disponíveis, e ficaria restrita aos casos de falha na resposta ao tratamento.

No mercado há diversos kits comerciais para a detecção de IgG anti-H. pylori por enzima imunoensaio. Esses ensaios se baseiam em antígenos e urease de cepas de H. pylori adsorvidos a pérolas ou microplacas. A IgG anti-H. pylori presente na amostra de soro do paciente se liga aos antígenos da pérola ou da microplaca. Depois da lavagem, o complexo antígeno-anticorpo é detectado com conjugado de carneiro anti-IgG humana marcado com peroxidase e substrato. Uma cor azul se desenvolve, sendo que a intensidade da cor é proporcional à quantidade de IgG específica ao H. pylori. A leitura da cor é feita em comprimento de onda específico para cada fornecedor.

A sorologia para H. pylori é o método de escolha nos estudos epidemiológicos. O exame indica se o paciente já entrou em contato com a bactéria ou não. Caso o paciente tenha feito tratamento para erradicar a bactéria, o teste sorológico pode ficar positivo ainda por vários meses, não sendo muito apropriado para avaliar resposta ao tratamento. As determinações seriadas antes do tratamento e a cada 3 meses sugerem erradicação da bactéria, desde que haja queda na concentração do anticorpo. Outra limitação depende de o paciente mostrar resposta imune ao Helicobacter pylori.

O melhor método não invasivo é o teste respiratório com ¹⁴C-uréia ou ¹³C-uréia. O paciente deve tomar alguns cuidados caso tenha usado antibiótico, aguardando pelo menos um mês para fazer o exame. Os inibidores da secreção ácida devem ser suspensos uma semana antes, evitando os falsos negativos. O teste com ¹⁴C-uréia não é realizado em crianças, mulheres grávidas e amamentando por ser radioativo; nesses casos a opção é a ¹³C-uréia. O exame se baseia na ingestão de ¹⁴C-uréia; se o paciente tem H. pylori no estômago, a urease metaboliza a uréia em amônia e bicarbonato. O bicarbonato entra na corrente sangüínea e é expirado pelos pulmões sob forma de ¹⁴CO₂.

No nosso departamento foi implantado o teste com ¹⁴C-uréia em 1997. O paciente ingere 5 uCi em jejum e permanece sentado durante todo o tempo do exame. Após 20 minutos o paciente sopra num sistema que contém 1 mmol de hidróxido de benzetônio em metanol com timolftaleína. A timolftaleína é indicador de pH: em pH alcalino é azul, em pH ácido é incolor. O hidróxido de benzetônio é alcalino, sendo originalmente azul na presença da timolftaleína. Depois que o paciente sopra e 1 mmol de CO₂ fica retido no meio, a cor vira de azul para incolor. São acrescentados 10 mL de líquido de cintilação e a leitura é realizada em contador c. As instituições de pesquisa geralmente dispõem de contador b, sendo mais barato implantar essa técnica. No nosso estudo, o valor de corte foi 562 cpm. Na prática diária, nós consideramos leituras entre 562 e 1000 cpm duvidosas. Acima de 1000 cpm, o teste é positivo.

O teste respiratório com ¹³C-uréia exige a aquisição de equipamento próprio para leitura, sendo referido como menos sensível do que a técnica com ¹⁴C-uréia, mas tem a grande vantagem de não ser radioativo. Ambos são de igual valor diagnóstico.

Por intermédio da sorologia também pode-se pesquisar IgG anti-vacA e IgG anti-cagA, determinando o status da cepa para o cagA e se é secretora de citotoxina vacA. Os kits empregados tanto podem ser de enzima imunoensaio quanto de Western Blotting. O resultado do teste, entretanto, depende de o paciente ser imunologicamente responsivo aos antígenos vacA e cagA.

No nosso departamento, a técnica empregada para a genotipagem da cepa consiste na extração de DNA a partir de biópsia gástrica de CLO positivo. A seqüência sinal (s) e a do meio (m) da citotoxina vacA e o gene cagA são amplificados por PCR (reação de polimerização em cadeia) com oligonucleotídeos específicos para s1a, s1b, s2, m1, m2 e cagA. A endoscopia digestiva alta é necessária para realizar-se a genotipagem que nos revela os gens já descritos no genoma do H. pylori. A sorologia isoladamente só permitirá identificar cagA e vacA.